Proenzymet aktiveras när en eller flera av dess peptidbindningar spjälkas genom enzymatisk eller sur hydrolys (reaktion med vatten under inverkan av enzym eller syra). Enzymets aktiva centrum blir då tillgängligt. Vissa matspjälkningsenzymer, komplementfaktorer och koagulationsfaktorer bildas som proenzymer vilka aktiveras vid behov.